От пробирки до кастрюли: Как ученые разрабатывают продукты, которые мы едим каждый день - Анастасия Волчок

CRISPR/Cas: как бактерии научили биологов разрезать ДНК

Все началось даже не с бактерий, а с архей – одноклеточных организмов, которые похожи на бактерии, но имеют свою эволюционную историю. Как и у бактерий, у них нет ядра, а сами они такие же маленькие, но некоторые другие характеристики архей принципиально отличаются, из-за чего в конце XX в. учеными было решено выделить их в отдельный домен. Особенностью архей считается их пристрастие жить в экстремальных условиях, например в горячих источниках и соленых озерах.

Итак, молодой докторант Университета Аликанте Франсиско Мохика, работая в маленьком городке в Испании, в 1989 г. нашел в ДНК микроскопических архей Haloferax mediterranei странные повторяющиеся 30-нуклеотидные фрагменты, разделенные неповторяющимися участками (спейсерами) примерно такой же длины. Его заинтересовала их функция. Он назвал эти участки CRISPR – clustered regularly interspaced short palindromic repeats – и начал искать похожие кластеры в ДНК других архей и бактерий. Оказалось, что CRISPR крайне распространены у прокариот. Они нашлись и у E.coli, и у других бактерий, включая патогенные виды. Следовательно, они зачем-то нужны.

После статей Мохики CRISPR начали изучать подробнее. Выяснили, что к повторам прилегают однотипные группы генов, назначение которых также неясно. Это были гены Cas – CRISPR-associated genes. И вот в 2003 г. Мохика совершает еще одно открытие: сравнивая последовательности в базах данных, он видит, что один из спейсеров CRISPR штамма кишечной палочки, устойчивой к бактериофагу P1, совпадает с ДНК этого самого фага. Мохика делает предположение, что CRISPR/Cas-система предназначена для борьбы с фагами, то есть имеет отношение к бактериальному приобретенному иммунитету. Тогда ученый не знал, какое значение имела эта догадка, но понимал, что наткнулся на нечто важное. Он написал новую статью, надеясь на публикацию в престижном издании. И хотя в Nature печатать его работу отказались, зато ее принял Journal of Molecular Evolution.

Параллельно с Мохикой над исследованием CRISPR/Cas работали и другие группы ученых. Уже через три года после его последней публикации появилось несколько работ, подтверждавших теорию Мохики по поводу функции загадочных палиндромов. А вот в действии CRISPR/Cas впервые проверили пищевые биотехнологи. Группа француза Филиппа Хорвата, пытаясь научиться эффективно отбирать сильные штаммы лактобактерий Streptococcus thermophilus для изготовления йогурта и сыра, показала, что стрептококки с большим количеством спейсерных участков в CRISPR лучше противостояли вирусам. Контролируя процесс, микробиологи заражали лабораторные стрептококки вирусами, тренируя тем самым их иммунную систему. Бактерии накапливали спейсеры и становились все более устойчивыми к фагам, что делало их эффективной основой для получения заквасок. «Криспризованный» таким образом йогурт вполне может стоять в вашем холодильнике. Он не содержит ГМО, бактерии в нем натуральные, просто их CRISPR/Cas-система натренирована лучше, чем у других. Можно считать, что они прошли полный курс профилактических прививок, а потому гораздо реже болеют[12].

Эта же команда первой описала механизм работы белков Cas5 и Cas9. Интерес к феномену CRISPR возрастал. До разработки эпохальной технологии модификации генов оставалось всего ничего. В следующие несколько лет было установлено, что CRISPR/Cas – программируемая нуклеазная система, где молекула РНК, считанная с CRISPR, за счет своих спейсерных участков узнает ДНК чужеродных фагов, которые уже встречались с бактерией раньше, а прикрепленный к ней Cas-белок разрезает эту вражескую ДНК (рис. 5).

Понимание того, что CRISPR/Cas можно использовать для нарезания ДНК клеток высших организмов, пришло практически мгновенно. Стартовали множественные эксперименты по ее использованию. На базе природных систем стали создавать упрощенные искусственные конструкции, включающие белок-киллер Cas9. Наконец в 2012 г. две женщины-биолога, Эмманюэль Шарпантье и Дженнифер Дудна, разработали рабочую инженерную систему CRISPR/Cas9 (через восемь лет они получат за нее Нобелевскую премию)[13], а генная инженерия преобразилась.

Рис. 5. Принцип работы защитного CRISPR/Cas-механизма бактерии при попадании в клетку бактериофага

При помощи CRISPR/Cas9 стало возможным успешно проводить все виды модификаций генома: вносить точечные мутации, встраивать, исправлять, заменять или удалять крупные ДНК-последовательности и фрагменты выбранных генов (рис. 6).

Сегодня CRISPR/Cas9 и родственные ей усовершенствованные системы применяются во множестве лабораторий и компаний. Уже опубликованы сотни результатов работ, проводимых с применением CRISPR, описаны десятки удачных экспериментов по редактированию геномов дрожжей, растений, насекомых и животных. С помощью генетических ножниц, например, были внесены точные модификации в геномы пшеницы и табака, получены новые сорта риса[14]. Больше того, на базе этой технологии уже существует первое лекарство для людей – Casgevy. Оно лечит серповидноклеточную анемию, редактируя сломанный ген в предшественниках красных стволовых телец – гемопоэтических стволовых клетках. После лечения клетки начинают производить полноценный гемоглобин вместо аномального, характерного для болезни.

Рис. 6. Виды различных воздействий, проводимых с помощью CRISPR/Cas9-конструкции

С приходом CRISPR риск неспецифического воздействия на ДНК пусть и не исчез совсем, но крайне минимизировался. Следовательно, безопасность методов генной инженерии вышла на новый уровень. Использование CRISPR/Cas не идет ни в какое сравнение с предыдущими поколениями нуклеаз, не говоря уже о ненаправленном мутагенезе или соматической гибридизации, когда клетки двух разных растений просто заставляют слипнуться, перетасовывая их гены в надежде получить удачный гибрид. Это все равно что дать одному противнику в руки пушку, а другому – пинцет.

Кроме того, что изменились сами методы редактирования генома, эволюционировал и подход к получению ГМ-продуктов. С новыми возможностями степень измененности ГМ-растений постепенно начала снижаться. Теперь далеко не все они – «франкенфуд» с генами из далеких друг от друга организмов, вроде помидоров с генами камбалы, которые в свое время наделали много шума в сети (эта разработка компании DNA Plant Technology до рынка так и не добралась, а сама компания обанкротилась)[15]. Многие ГМ-сорта включают гены из других растений, что уже не выглядит столь кощунственно, но и тут уровень вмешательства разнится. Взять, например, рис с генами кукурузы. Скрестить эти два растения невозможно, а потому перенос генов кукурузы в рис называется трансгенезом – это когда в организм переносят чужеродные для него гены, которые не могли бы оказаться в нем натуральным путем. Но часто ученые добавляют в свои сорта гены из родственных видов. Это уже организмы не трансгенные, а цисгенные. Так, в Швеции разработали картофель, не подверженный картофельной гнили благодаря встраиванию генов из диких видов картофеля, устойчивых к этому заболеванию[16]. Нередки также случаи, когда в ДНК растения вставляют копии его собственных генов или меняют не гены, а вспомогательные участки, отвечающие за активность считывания генетической информации. Это позволяет усиливать определенные признаки – например, способность накапливать